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pcr是什么意思,实时定量PCR应用中的问题及优化

时间:2019-11-13 21:04来源:医学科学
1、分子诊断在肿瘤研究中的意义1.1肿瘤易感基因的检测:肿瘤遗传相关的易感基因检测对于肿瘤高危人群的筛检具有实用价值,已明确的肿瘤易感基因及其相关肿瘤有Rb1、WT1。p53(Li-F

1、分子诊断在肿瘤研究中的意义 1.1肿瘤易感基因的检测:肿瘤遗传相关的易感基因检测对于肿瘤高危人群的筛检具有实用价值,已明确的肿瘤易感基因及其相关肿瘤有Rb1、WT1。p53(Li-Fraumeni综合征)、APC(家族性腺瘤性息肉病)、HNPCC(遗传性非息肉病性结肠癌)、NF1、VHL(VonHippel-Lindau综合征)、PTEN(Bannayan-Riley-Ruvalcaba综合征)、BRCA(家庭性乳腺癌、卵巢癌)等。除了检测高危人群的易感基因外,有方法也应用于正常人群肿瘤易感性检测,如检测Ret基因突变用于诊断Ⅱ型多发性内分泌肿瘤,通过分析GST基因型以判断个体暴露于致癌物时的致癌危险性等。 1.2肿瘤的分类:判断淋巴细胞增生与淋巴细胞性肿瘤及其克隆起源,应用RFLP分析免疫球蛋白或T细胞受体基因重排,具有鉴别诊断作用,且这种分子病理分型比免疫学分型更为准确。对Bcr区基因重排的检测,可对慢粒和急粒进行鉴别诊断。N-myc和C-myc扩增和表达的检测,对鉴别神经母细胞瘤和神经上皮瘤具有应用价值,因前者N-myc明显扩增,而后者则为C-myc明显扩增。 1.3肿瘤的早期诊断:K-ras基因突变是一种胰腺癌、结肠癌和肺癌等肿瘤中发生率较高的分子事件,突变集中在第12、13和61编码子。应用细针穿刺活检材料检测胰腺癌的第12编码子变突,检出率可达100%,应用PCR-RFLP方法检测结肠癌患者粪便中的Ras基因突变,其检出率与瘤组织中相似,可用于高危人群的筛选。 1.4肿瘤的预后判断:肿瘤基因的突变、扩增及过表达等改变常与肿瘤的预后密切相关,如p53基因突变与乳腺癌、肝癌、结肠癌等多种肿瘤预后有关,nm23的状态则与肿瘤转移相关。研究发现从分子水平上判断肿瘤的生物学行为及预后具有较高的准确性。如Vogelstein根据结肠癌相关基因的变化,提出了结肠癌癌变和演进的分子模型,阐述了癌基因激活、抑癌基因失活与肠上皮细胞增生、癌前状态、癌变和转移各阶段基因变化的特征。此外,文献中对胃癌、肝癌、肺癌等也提出了类似的分子模型。 1.5肿瘤的预后监测:分子诊断在肿瘤的监测方面也具有重要的作用,如临床治疗缓解期内白血病的白血病细胞仍达1011,用细胞遗传学方法检出率约为1%~5%,应用核酸杂交技术灵敏度可达0.15%~0.05%,而PCR技术则可使检出率达到10-6左右。提高了对肿瘤转移、复发监测的准确性,有助于及时采取适当的治疗措施 1.6为肿瘤个体化和预见性治疗提供依据:肿瘤发生、发展的不同时期,可能涉及不同基因的不同变化形式,而基因的变化及基因间的信号传递与肿瘤临床治疗的敏感性密切相关,如能在分子水平对肿瘤基因变化提供指标,对肿瘤的个体化和预见性治疗具有指导意义。如在90%的胰腺癌、50%的结肠癌、30%的非小细胞肺癌中存在Ras基因的激活,50%左右的肿瘤有p53基因不同形式的突变,这些基因的异常,使肿瘤对某些放疗或化疗的方法具有抵抗性,如能从基因水平上改变异常基因的状态,则可提高放、化疗的敏感性。 2、分子诊断在肿瘤研究中的应用 2.1基因过表达的检测:癌基因的激活和抑癌基因的失活是肿瘤发生过程中的关键因素。癌基因的激活有多种表现形式,其中基因产物过表达为重要形式之一,可表现为mRNA和蛋白质量的增加,此外,基因扩增可表现为基因拷贝数的增加,这些基因表达的异常,均可加以检测。 2.1.1表达产物的检测:蛋白质水平基因表达产物的检测最常用的方法为免疫组化技术,也可应用酶联免疫吸附和Western蛋白印渍法。新一代测定方法为流式细胞仪法(flowcytometry),更新的影像细胞测试法(imagecytometry)则可应用特定波长的光密度进行积分,进行特定蛋白质的定量分析。 2.1.2基因扩增的检测:基因扩增主要表现为基因拷贝数的增加和转录产物mRNA的增加,经典方法为DNA和RNA和印渍杂交。但应用更普遍的为组织细胞原位核酸分子杂交,包括原位杂交、荧光原位杂交、对比基因组杂交。近年发展较快的荧光原位杂交和对比基因组杂交在肿瘤分子诊断中具有重要的应用价值。原位PCR技术作为一种敏感性高、特异性强、能在组织细胞原位进行低拷贝数基因定位的研究方法,在分子诊断中发挥了重要作用,其灵敏度比原位杂交高出2个数量级,是形态学和分子生物学前沿交叉的产物,对前沿研究和学科发展起着巨大作用。Anderson曾在1994年生动地指出“原位PCR使光学显微镜超过电子显微镜在向生物化学和遗传学领域延伸。” 2.2基因突变的检测:癌基因和抑癌基因突变是肿瘤发生中出现频率较高的分子事件,不仅在肿瘤细胞中可检测到突变基因,在一些癌前病变或癌前状态的组织细胞中也存在不同形式和程度的基因突变,基因突变的检测对研究肿瘤发生机制、诊断和鉴别诊断、预后评估及治疗方案选择等都有重要价值。基因突变形式主要有点突变、基因缺失(1~2个碱基缺失,一个片段或一个外显子缺失)、基因易位或重排、基因插入、甲基化及染色体非组蛋白改变等。 基因突变及其检测方法研究已成为生命科学研究的热点。1985年以前,主要应用Southern杂交,可筛选出基因的缺失、插入和移码重组等突变形式,对于不能用该法检测的突变,也可用NDA序列测定分析,但复杂费时。促进了基因突变检测技术的发展,目前大部分基因突变检测技术都是以PCR为基础,已达20余种,比较成熟的技术包括PCR-SSCP法、杂合双链分析法、突变体富集PCR法、变性梯度凝胶电泳和温度梯度凝胶电泳法、化学切割错配法、等位基因特异性寡核苷酸分析法、DNA芯片技术、连接酶反应、等位基因特异性扩增法、RNA酶A切割法、荧光原位杂交、寡核苷酸引物原位DNA合成法、比较基因组杂交法和DNA序列分析等。 2.3限制性酶切片段长度多态性分析:通过对DNA分子的分析识别特定基因组区域的丢失及扩增,其中较重要的一种研究为应用同一个体的正常体细胞(血细胞或瘤旁正常组织)及肿瘤细胞的DNA,检查DNA多态性座位上等位基因的不平衡性,当两个等位基因的相关性密度在正常与肿瘤细胞之间出现显著性差异时,就提示肿瘤细胞中多态性序列座位处出现突变,当DNA序列的差异发生在限制性酶识别位点或当DNA片段插入、缺失或重复,可使基因组DNA经限制性内切酶水解发生片段长度改变,在不同个体间可出现不同长度的限制性片段类型,故称为限制性酶切片段长度多态性。RFLP技术可直接分析癌组织中某些基因在染色体上的变异及其与肿瘤发生的关系,精确位点的RFLP分析还是发现新的肿瘤基因的有效手段。目前能用于RFLP分析的肿瘤基因探针和基因位点探针已有数百种,覆盖了人类23对染色体,是肿瘤分子诊断的重要方法之一。 2.4微卫星不稳定性分析:微卫星不稳定性检测是基于数量可变串联重复序列的发现,细胞基因组含有大量碱基重复序列,一般将6~70bp的串联重复称为小卫星DNA或VNTR,1~4bp的串联重复称为微卫星DNA或简单重复序列,SRS为新的DNA多态性标志之一。微卫星不稳定性是指SRS的增加或丢失,特别是在DNA错配修复系统缺损的肿瘤基因组中,常显示大量MI。MI仅在瘤细胞中发现,目前已发现存在于肠癌、胃癌、肺癌、乳腺癌、肝癌等多种肿瘤组织。检测MI方法为PCR扩增及电泳分析,如结合显微切割技术,则可使检测目的更为明确。 2.5端粒酶及其检测:端粒酶与肿瘤关系的研究是近年来十分活跃且发展迅速的领域之一,近年的研究表明,人类肿瘤中85%左右的肿瘤细胞存在端粒酶活性表达,对端粒酶的研究有可能为肿瘤的发生发展、诊断、预后等提供指标,并可能以抑制端粒酶表达为手段作为肿瘤治疗的新方法。 端粒酶活性检测经典方法为端粒重复扩增技术,TRAP法分析结果是非线性的,样品间的比较和定量比较困难,且操作复杂,也不适用于小样品,而且由于有些组织中含有Taq酶抑制物,会出现假阴性结果,目前不少研究者致力于端粒酶检测方法的改进,有人应用接近闪烁分析技术,在96孔板上进行TRAP操作,可用作大规模临床样本及端粒酶抑制剂的筛选。ELISA法是利用端粒酶在生物素标记的引物上加入多个6核苷酸端粒重复序列,反应产物用生物素标记的引物进行PCR扩增,与地高辛标记的探针杂交,再与抗生物素蛋白包被的微量滴定板结合,该法省时且无放射性污染,可减少假阴性。原位杂交法检测端粒酶活性也有报道,有可能通过原位杂交区分正常和肿瘤细胞,但仍有待于进一步的成熟,稳定。 3、肿瘤分子诊断的发展前景及其标准化 分子诊断技术是肿瘤分子病理研究具有划时代意义的检测手段,拓宽了病理学研究的范围,使我们对肿瘤发生发展、形态特征、生物学行为的认识进入分子水平,分子诊断的大部分技术已日趋成熟,但目前还主要用于研究领域,真正用于临床检测的技术开展得还比较少,费用昂贵、操作复杂是重要原因,分子诊断技术也不能完全取代许多目前使用的行之有效的实验室诊断方法。肿瘤病理诊断仍应坚持以形态学为基础的原则,分子诊断只是这些方法的补充、改善和提高。 分子诊断目前仍存在一些问题,由于其技术一般都具有敏感性高的特点,特别是PCR技术,结果影响因素较多,最大的问题为技术性假阳性和假阴性,PCR技术本身已比较成熟,要使检测技术具有高敏感性,又要确保检测结果的高特异性和重复性,质量控制至关重要,关键在于建立标准化的实验操作程序和标准化的分子诊断实验室,除诊断技术方面的标准化外,诊断指标也要实行标准化,这样才有可能对肿瘤的诊断、鉴别诊断、浸润转移、临床治疗方案的选择及生物学行为的评估等方面提供有意义的指标,这将是每位病理学家所面临的机遇和挑战。

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核心提示: 基因结构的异常可引起多种疾病的发生,它包括点突变、插入、缺失、重排、易位、基因扩增、基因 基因结构的异常可引起多种疾病的发生,它包括点突变、插入、缺失、重排、易位、基因扩增、基因结构多态性异常等形式。许多人类遗传性疾病源于基因的突变,基因突变分析是指对单个或低拷贝基因序列等位基因改变的鉴别,对诊断和理解遗传病有非常重要的价值。 聚合酶链反应是一种高特异和高灵敏性的基因分析手段,PCR操作简便,可以在几个小时内使DNA段的拷贝数扩增百万倍,使对微量DNA的分析鉴定成为可能,伴随着分子生物学各领域的飞速发展,PCR及其衍生技术以其快速准确在基因突变的检测中得到了广泛的应用。 虽然特异基因序列区段的直接测序是基因突变分析最可信和最精确的手段,但该方法繁琐、耗时、费力。PCR的应用则提供了一系列比直接测序更方便、快捷的方法。PCR在此领域也引起了巨大的革新。基于PCR技术的常用基因突变检测方法有:1、 PCR/ASO PCR/ASO探针诊断点突变,系在扩增DNA段后,直接与相应的寡核苷酸探针杂交,来明确诊断是否有突变以及突变是纯合子还是杂合子。2、 PCR-SSCP PCR-SSCP系1989年由Orita首先报道的,它是一种基于单链DNA构象差别来检测点突变的方法。该方法操作简单、灵敏且特异性高,是目前检测点突变最简捷的方法。3、 PCR-RFLP RFLP分析与PCR反应相结合,先用PCR来扩增待检的片段,再进行RFLP来检测那些发生在酶切位点的突变简化了RFLP的分析过程,并使该项技术得到了广泛的应用。4、 DNA序列测定法PCR产物经克隆后测序或直接对PCR产物进行测序是所有进行基因突变检测的方法中最灵敏、最直接、最全面的,不仅可以确定突变的部位,还可以确定突变的性质。尤以循环测序法最具有代表性,该方法以TaqDNA聚合酶代替测序酶。测序反应通过多次的变性、退火、延伸来完成,具有快速、简便、灵敏等优点。但是DNA序列测定法所需的仪器和高昂的费用限制了它在临床诊断中的应用。5、 异源双链分析该方法类似于SSCP。在一个PCR反应中,如果同时存在野生型和突变型的DNA模板,那么在PCR循环中突变型和野生型DNA形成的杂合双链DNA分子即异源双链DNA段,它与同源双链在聚丙烯酰胺电泳中呈现不同的电泳速率,经聚丙烯酰胺电泳就可以将仅有一个碱基改变的异源双链片段与同源双链片段分开,从而达到诊断碱基突变的目的。该方法依赖于双链DNA分子序列依赖性的构象变化。对于小于300bp的小DNA段其敏感性较好,且已在许多遗传性疾病中得到应用。6、 变性梯度凝胶电泳DGGE是一项根据DNA解链特性分离鉴定DNA段的技术。在温度和变性剂浓度增加时,DNA分子内一些称为变性区域的独立片段将发生变性。PCR扩增片段通过一线性增加的变性凝胶电泳体系时,一旦进入相当于某些区域解链温度的变性剂浓度区将会解链形成分叉的DNA分子,并因此使迁移率显著下降。变性区域的解链温度由其核苷组成决定,序列中发生一个碱基的改变,其解链温度Tm改变1.5℃,在变性梯度凝胶上表现出不同的迁移率。同SSCP比较,DGGE需要制备新鲜的梯度胶,检出率也较低,且只能确定突变的存在,不能进行突变位置和性质的定量分析。但DGGE无需知道待测片段的DNA序列,无需制备测试引物。7、 化学错配裂解法 CMC是将同位素标记过的野生型DNA分子和突变型DNA段混合后经过变性与复性, 形成DNA-DNA或DNA-RNA的异源杂交双链,在突变部位会产生凸起。对凸起处错配碱基进行化学修饰并使之从双链分子上断开,通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及放射自显影即可确定是否有突变发生。CMC法最大优点是能对放大片段进行“扫描”式分析,存在于序列中任何部位的突变都能被检出,多用于多基因突变的遗传病。 此外还有等位特异性PCR、PCR核糖体分型技术、可变数目***重复序列和短***重复序列分析等方法可用于基因突变的分析。这些方法各有所长,具有不同的优缺点,在不同的领域内有着不同的应用。无论是哪种检测技术都体现了PCR技术本身所具有的优越性,在实际应用时,可根据实验目的和具体需要,选择最恰当的方法或将不同的方法联合应用,PCR的应用将使基因突变检测技术有更广阔的应用前景。阅读全文

核心提示:背景:生物科学和有关技术的发展为恶性肿瘤的诊断和治疗提供了分子学依据。当前,外科病理学主要依据肿瘤的解剖特点(如:转移瘤

PCR是1985年由美国PE-Cetus公司的科学家Kary Banks Mullis发明的一种可在体外快速扩增特定基因或DNA序列的技术。经历了近30年的技术发展,现如今PCR技术在生物科学研究以及相关的很多领域都得到广泛的应用。那么pcr到底是干什么的呢?下面贤集网小编为大家说一下pcr是什么意思,pcr技术原理及pcr技术步骤、pcr技术分类、pcr技术应用,一起来看看吧。

背景:生物科学和有关技术的发展为恶性肿瘤的诊断和治疗提供了分子学依据。当前,外科病理学主要依据肿瘤的解剖特点和组织病理学对恶性肿瘤分类。微阵列连同聚类分析揭示了肿瘤分子的差异多样性,靠这一点有望建立一个新的与预后有关的分类方法,更重要的是,对疗效有重要的意义。病理学上的挑战将成为常规临床应用分子学分类的发展和补充。

pcr是什么意思

方法:本文重点放在临床实验室中用以DNA为基础的PCR技术来了解实体肿瘤的概况,并讨论这种技术的意义、发展和可能性。

合酶链式反应简称PCR(又称:多聚酶链式反应)PCR是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法,由高温变性、低温退火及适温延伸等反应组成一个周期,循环进行,使目的DNA得以迅速扩增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究,还可用于疾病的诊断或任何有DNA,RNA的地方。PCR又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。

内容:分子标志物可以为我们提供准确的预后和机体对治疗的反应、耐药性和毒副作用。由于与肿瘤恶性有关的基因改变的多样性,要得到肿瘤完整的特征,需要进行各种实验。一些新的肿瘤分子学分类是以基因表达为基础的,需要在标本的处理过程中保持RNA的完整。更多稳定的分子标志物在临床实验室中广泛应用。实时定量PCR可以测定基因的重复和缺失。另外,PCR后立即进行熔化曲线分析可以辨别很小的突变和甚至单个碱基的变化。这种技术变得越来越简单和快速并且可以进行多重测量。进行肿瘤标志物分析,实时定量PCR技术无疑是一种有利的选择。

pcr技术原理

总结:将最近在肿瘤学方面的发现介绍到临床应用中是很有必要的。这需要客观的、完善的、合算的分子技术用于临床试验,最终用于常规检测。实时定量PCR在实验室对肿瘤特性研究的应用前景诱人。

PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程,其特异性主要依赖于和靶序列两端互补的寡核苷酸引物,它由变性——复性——延伸三个基本反应步骤构成。首先,根据靶序列DNA片段两端的核苷酸序列,合成两个不同的寡聚核苷酸引物,它们分别与DNA的两条链互补配对。将适量的寡聚核苷酸引物与四种脱氧核糖核苷三磷酸、DNA聚合酶以及含有靶序列片段的DNA分子混合,经过高温变性使DNA双链解开、低温复性使底物与模板附着和中温延伸合成新的DNA片段这三个阶段的一次循环,DNA的量即可增加一倍,而循环n次,则DNA的量增加2n倍,扩增反应迅速地循环,产生了大量相同的片段,每一片段中均包含目的DNA片段。

现在大部分人类基因组的序列可获得,可用于了解、定性和治疗复杂疾病如恶性肿瘤。对肿瘤的形态和临床表现不同等生物学差别,可以利用基因表达芯片、比较基因组杂交、原位荧光杂交、Q-PCR和突变分析等来分析。通常许多因素可以破坏正常细胞的调控,其中包括:病毒感染、DNA甲基化和基因序列改变。当这些因素影响到调控细胞分化、修复、凋亡和血管再生的基因时,肿瘤就发生了。当前的分子学技术已成为研究肿瘤生物学和发现导致肿瘤的内在和外部因素的有效工具。

模板DNA的变性:模板DNA经过加热至94℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,完成下一轮扩增反应;

微阵列连同聚类分析可以破译和比较分析生物系统中全基因组表达模式。分层收集不同条件下基因表达的微阵列数据。利用微阵列分析,研究者已经根据基因表达的不同对许多恶性肿瘤进行分类,例如:淋巴瘤、白血病、肺癌、遗传性及散发乳腺肿瘤。每一种肿瘤在其进展过程中都有一明显特征,显示其分子生物学历史。基于标本中的每一个细胞类型独特的表达特征,可以对肿瘤组织进行分子水平的解剖。例如:在乳腺肿瘤中,标本中的乳腺肿瘤细胞的特异基因表达能将其与其他细胞,如淋巴细胞和基质细胞区别开。另外,组织学分类中的分子亚型细胞也能区分。例如:慢性B细胞淋巴细胞白血病有两种类型,弥漫性大B淋巴细胞瘤有两种类型,非小细胞肺癌有五种类型,侵入性导管细胞乳腺肿瘤至少有四种分子学类型。这些分子亚型很重要,因为可以利用它们来预测病人的结局和解释解剖诊断一样的肿瘤在自然转归中的变化。

模板DNA与引物的复性:模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;

还可以从肿瘤相关的突变得到各多的信息。基因表达谱有时可以反映特定基因的突变。目前为止,在人类肿瘤中最普遍的突变是抑癌基因的突变如:p53。、50%以上的恶性肿瘤存在p53基因突变,在头、脖、肺、皮肤、膀胱和结肠癌中尤为常见。p53突变与肿瘤的侵袭生长的组织特征、早期浸润和耐药有关。在乳腺癌中p53的突变率为20%-30%。多变量分析表明p53突变是乳腺癌对他莫西分治疗反应差的一个独立的预测指标。核酸技术在检测p53状态上比免疫组织化学法好。在许多肿瘤中,IHC检测的p53与突变的状态有关,但是一致性差。在外科病理学中IHC是一个检测分子标志物的简单方法,但是它易因抗体特异性的不同、评分的标准以及贮存因素而发生变化。另外,核酸技术还可分析治疗反应相关特异突变,为残余疾病提供分子标志物。

引物的延伸:DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列DNA序列为模板,按碱基互补配对与半保留复制原理,从5’端到3’端延伸出一条新的与模板链互补的半保留复制连,重复循环变性——复性——延伸三个过程就可获得更多的“半保留复制连”,以这些新链为模板就可进行下一次的PCR循环。

在病理学中对实体肿瘤标志物的需要是很明确的。但是怎样用好这些新的实验方法是不确定的。例如,为了保持组织结构的完整性,要将标本用福尔马林固定石蜡埋片。但是这样将会导致mRNA的回收不可靠。因此,用微阵列分析或者逆转录来进行表达分析是不可行的,除非我们改变实体肿瘤标本的保留方法。DNA和蛋白质标志物在结构上比RNA标志物稳定,可以在外科病理学中利用这些标志物来确认突变的状态和基因的表达。

pcr技术步骤

定量分析

PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成:

IHC是一种针对蛋白质表达的半定量技术,解剖病理学家可以用光学显微镜来分析。IHC很经济,而且检测标志物同时可进行组织学评价,但它是一种很容易出现错误的方法。这一点在计算乳腺癌中HER--2蛋白的过量表达中尤其明显。HER--2阳性表明有肿瘤恶化和预后差。曾提倡用以IHC为基础的检测HER--2蛋白的“HercepTest”用于预测对“Herceptin”的反应。但是它很难区别背景染色和弱阳性结果。另外,不同的商品化抗体可以产生不同的结果。因HER—2 IHC有困难,所以大多数实验室用FISH法来代替它来检测HER--2基因的扩增。FDA批准了两中FISH方法用于检测HER—2。两种FISH法有很好的一致性,但是同IHC一致性很差。HER—2检测的这一经历突出了实体肿瘤分子分析中实验的相容性和可靠性的要求,随着更多标志物的出现和应用,这种需要将更迫切。

模板DNA的变性

实时定量PCR

模板DNA经加热至93℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;

实时定量PCR技术的进展与微阵列技术同步。这种技术是均质方法,它包括扩增和分析,不需要铺凝胶,无放射性以及样本处理。现在有不少可用的商品化平台,即可以检测荧光的热循环仪。PCR过程中,检测每一个循环中DNA染料或探针的荧光强度。达到一定循环数,产物的聚集使其荧光强度超过了背景。这一点量化为第二衍生最大值,Cp同初始模板的拷贝相关。

模板DNA与引物的退火(复性)

初始模板拷贝数多,荧光出现早,Cp值低。可以根据Cp值的不同来判断两样本的相对拷贝数。因为PCR是一个指数过程,相对拷贝数等于PCR效率的△Cp次方。由于难以得到不同样本中的DNA总数量,通常用假定不变参考基因对检测基因的结果标准化。对给定肿瘤基因组稳定区可以用CGH来确认,用作DNA的质控。一种经济和常用的替代微阵列分析的方法就是实时PCR的相对定量法,它是利用SYBR Green I做双链DNA产物的荧光指示剂。

模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;

Cp值和初始拷贝数的关系和利用Cp值和初始拷贝数计算PCR扩增效率的方法见图2A,B。PCR扩增曲线利用血清中蛋白的特异探针产生。白细胞DNA基因组浓度10倍系列稀释物的。对每一个稀释度以每个循环的荧光强度和循环数为参数来作扩增曲线。以DNA基因组的对数和每一个稀释物的Cp值做回归直线来计算PCR反应的平均效率。这个效率可以用下面的公式计算。直线的y轴截距表示最低检测限。

引物的延伸

用多重实时PCR进行诊断

DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链,重复循环变性--退火--延伸三过程,就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2~4分钟,2~3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。

实时定量PCR可以在单一反应中同时测多个基因。多重检测最主要的优点是,它提供内标,降低试剂成本以及保存珍贵标本。在分析微解剖组织标本的多个目的基因时,多重分析显得尤其重要。因为正常二倍体细胞中的DNA可以干扰基因的拷贝数,需要对实体进行肿瘤微解剖。从微解剖组织中提取核酸的方法已建立。HER-2和TOPOⅡα的DNA定量分析对乳腺癌的预后和治疗意义重大。约有20%的乳腺癌HER--2基因在DNA水平上扩增,导致蛋白信息增加和蛋白的过量表达。topoIIα基因位置邻近HER-2基因,定位于染色体的17q12- q21,此区在乳腺肿瘤时频繁出现突变。HER-2DNA扩增可伴随topoII的变化,topoII的拷贝数可以影响抗topoII药物的治疗效果。

PCR的反应动力学PCR的三个反应步骤反复进行,使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA扩增量可用Y=(1+X)n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数,X表示平(Y)均每次的扩增效率,n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%,但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期,靶序列DNA片段的增加呈指数形式,随着PCR产物的逐渐积累,被扩增的DNA片段不再呈指数增加,而进入线性增长期或静止期,即出现“停滞效应”,这种效应称平台期数、PCR扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竞争等因素。大多数情况下,平台期的到来是不可避免的。

用三色PCR反应同时检测HER-2和topoII基因相对于控制基因白蛋白基因的初始拷贝数。三组相近的探针中与荧光素配对的染料分别为:HER-2—LCRed640,白蛋白—Cy5,topoII—LCRed705。每一个对象由不同标记探针发射的荧光来鉴别。这些染料产生的波长的重叠区用软件处理,得到每个探针的特异信号。实验中用多重反应来确定每一基因的扩增效能。如果三个对象存在相同的拷贝数和扩增效率,三者将会有相同的Cp值。图三比较了野生型白细胞基因组DNA和乳腺癌分离的DNA扩增。同预测的一样,野生型DNA基因组中三者的Cp值是一样的,但是在肿瘤标本中HER-2和topoII的Cp值的变化比控制蛋白早出现。这相当于这些基因八倍扩增。用CHG和cDNA芯片分析发现在这个肿瘤标本中有这两种DNA的扩增与mRNA的过表达。

pcr技术分类

突变分析

(1)反向PCR技术

用实时PCR检测实体肿瘤的突变

反向PCR是克隆已知序列旁侧序列的一种方法。主要原理是用一种在已知序列中无切点的限制性内切酶消化基因组DNA.后酶切片段自身环化。以环化的DNA作为模板,用一对与已知序列两端特异性结合的引物,扩增夹在中间的未知序列。该扩增产物是线性的DNA片段,大小取决于上述限制性内切酶在已知基闲侧翼DNA序列内部的酶切位点分布情况。用不同的限制性内切酶消化,可以得到大小不同的模板DNA,再通过反向PCR获得未知片段。

DNA突变包括重排如转位、倒置,基因扩增和缺失,以及一些小的变化如点突变和碱基的插入和缺失。较大的变化一般出现在血液恶性肿瘤中,通常用细胞遗传学技术如FISH等分析。而小的变化通常出现在癌中,可用于临床常规检测实体瘤中小的细胞体突变的方法很少。

(2)锚定PCR技术

体细胞突变在许多肿瘤发展过程中出现,而且对恶性肿瘤的进程有重要的影响。抑癌基因p53突变在人类肿瘤中最多见。约有90%的p53突变是发生在DNA结合区,其中87%为单碱基改变。外显子5~8的突变是最好的转归指标。研究表明p53的热点突变,如273密码子,可能导致对anthracycline的耐药性,而anthracycline是治疗转移的乳腺癌的首选药物。p53突变可以用来监测复发和治疗效果。例如:肿瘤细胞死亡后p53核酸释放入血,可以检测病人血清的p53核酸。对突变DNA的检测可以用来定期监控。尽管p53的价值很大,对其是否用于临床常规检测仍有争议。原因在于不同检测方法的结果相矛盾,也没有可用于临床实验室的能弥补这一矛盾的技术。

用酶法在一通用引物反转录cDNA3’-末端加上一段已知序列,然后以此序列为引物结合位点对该cDNA进行扩增,称为APCR。

许多筛选方法和直接测序都用来确定基因型和疾病的关系。突变可引起单链构象和异源双链二聚体融化的改变,常规检测方法利用凝胶来解析由此导致的迁移率的转变。凝胶技术利用二聚体稳定性的不同来区别同源和异源双链二聚体,这些技术包括变性梯度凝胶电泳、连续变性凝胶电泳和短暂温度梯度凝胶电泳。或者,用化学方法或者酶消化,凝胶片段分离的方法来检测异源双链二聚体。检测方法的发展包括单链构象多态性分析与荧光相结合和使用变性HPLC。具有快速、灵敏度高、经济的体细胞突变检测方法将会在临床实验室中得到最大限度的应用。

(3)不对称PCR技术

在临床实验室中经常用荧光杂交探针对同种基因分型。例如:应用杂交探针的溶解曲线分析和来检测引起一般遗传性疾病的基因的微小生殖细胞突变/基因多态性,这类疾病有胆囊纤维化、静脉血栓、肺气肿、血色沉着病、和高胆固醇血症。溶解曲线分析和结合SYBR Green I可用来检测DNA甲基化,DNA甲基化导致转录沉寂。另外,单标记探针的溶解曲线分析能用来筛选体细胞突变。图四显示一组与野生型p53序列互补的荧光标记的有重叠序列的寡核苷酸探针检测两种不同的大肠癌中p53在6 exons和8exons上的突变。将探针设计为实验对象退火时荧光强度减少,这是因为脱氧核糖核苷的淬火作用。在循环仪中扩增后,仪器进入溶解程序,首先反应温度下降探针与靶结合,之后缓慢升温,同时连续监测荧光强度。通过特征性野生型溶解曲线的变化来鉴别体细胞突变。对未突变和突变克隆恶性肿瘤的溶解曲线进行比较,异常溶解峰的出现或者峰区比值的变化表明对应探针的序列变化。在同一个管中可应用多达三个探针进行多重溶解曲线分析,筛选~100bp 的区域。

两种引物浓度比例相差较大的PCR技术称不对称PCR。在扩增循环中引入不同的引物浓度,常用50~100÷1比例。在最初的10~15个循环中主要产物还是双链DNA,但当低浓度引物被消耗尽后,高浓度引物介导的PCR反应就会产生大量单链DNA。

概括

(4)反转录PCR技术

目前恶性肿瘤的研究焦点在新的分子标志物的重要性上。在外科病理学中分子标志物和组织形态学的联合将提供更精确的预后。另外,肿瘤的分子学定义可用于指导治疗和检测残留病。

当扩增模板为RNA时,需先通过反转录酶将其反转录为cDNA才能进行扩增。应用非常广泛,无论是分子生物学还是临床检验等都经常采用。

今天用于肿瘤研究的技术,如表达芯片和CGH,可以进行基因组范围的筛选和发现与肿瘤有关基因的变化。表达芯片可以用来确认同等调控基因,确定解释肿瘤之间不同临床表现的途径。CGH可以用于鉴别全基因组范围内的肿瘤发展过程中DNA的扩增或缺失的具体区。把这些技术联合起来,能够在多重分子水平上进行确认。例如CGH确认DNA在染色体7q处扩增,表达芯片显示,这包括HER-2,Grb-7,和topoII的复制子。在DNA水平上的靶基因的鉴定,允许使用福尔马林固定石蜡包埋的组织块。同时也适合现行的病理标本制作流程。表达芯片分析和CGH是发现肿瘤之间不同和癌变机制的强有力的工具。在不久的将来,肿瘤将会在导致肿瘤细胞分化和转移的生物学路径的基础上被定义和治疗,而不单单基于组织学表现。

(5)巢式PCR技术

可用于临床分子学分析的平台仍在改进。表达芯片分析和CGH对了解肿瘤的生物学特性很有效。然而,一旦肿瘤基因和控制基因被确认,这些方法用于临床诊断是不必要的。实时PCR在临床检测中的作用将越来越大,它可用于检测基因表达,基因扩增或丢失,以及小的改变。此外,它可用于检测和定量肿瘤的病毒因素,如EBV和HPV。实时PCR客观、快速、应用范围广、经济,可检测微小的组织标本,因此在分子诊断中的应用前景诱人。

先用一对靶序列的外引物扩增以提高模板量,然后再用一对内引物扩增以得到特异的PCR带,此为巢式PCR。若用一条外引物作内引物则称之为半巢式PCR。为减少巢式PCR的操作步骤可将外引物设计得比内引物长些,且用量较少,同时在第一次PCR时采用较高的退火温度而第二次采用较低的退火温度,这样在第一次PCR时,由于较高退火温度下内引物不能与模板结合,故只有外引物扩增产物,经过若干次循环,待外引物基本消耗尽,无需取出第一次PCR产物,只需降低退火即可直接进行PCR扩增。这不仅减少操作步骤,同时也降低了交叉污染的机会。这种PCR称中途进退式PCR,主要用于极少量DNA模板的扩增。

(6)多重PCR技术

在同一反应中用多组引物同时扩增几种基因片段,如果基因的某一区段有缺失,则相应的电泳谱上这一区带就会消失。主要用于同一病原体的分型及同时检测多种病原体、多个点突变的分子病的诊断。

(7)重组PCR技术

重组PCR技术是在两个PCR扩增体系中,两对引物分别由其中之一在其5’-端和3’-端引物上带上一段互补的序列,混合两种PCR扩增产物,经变性和复性,两组PCR产物互补序列发生粘连,其中一条重组杂合链能在PCR条件下发生聚合延伸反应,产生一个包含两个不同基因的杂合基因。

(8)原位PCR技术

利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段,在不破坏细胞的前提下,利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物。直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行PCR扩增,可进行细胞内定位,适用于检测病理切片中含量较少的靶序列。

(9)荧光定量实时PCR技术

实时荧光定量PCR是一种在DNA扩增反应中,以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。Real-timePCR是在PCR扩增过程中,通过荧光信号,对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期,模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系,所以成为定量的依据。

pcr技术应用

一、在医学中的应用

1)在传染病的诊断和研究中的应用

目前PCR在临床上应用广泛,其中前景最为广阔的是对传染病的诊断和研究。因为传染病的病原体无论是细菌,还是病毒或寄生虫,对于机体来说,就是一种外源入侵者,不论其致病是否由基因所致,只要病原体存在,机体内就会有其核酸存在,而且这种核酸顺序与人类基因组顺序往往不同,所以选择PCR技术进行诊断较细胞培养法、血清学方法更为简便、敏感和快速。

在检测病毒方面,做得比较多的是对结核、麻风、沙眼衣原体、金黄色葡萄球菌、霍乱弧菌等的检测和研究。

在检测病毒方面,做得比较多的是对艾滋、人乳头状瘤病毒、人T细胞淋巴瘤病毒、EB病毒、肝炎病毒等的研究。以前AIDS病的诊断主要采用的是血清学的方法。虽然血清学试可以确定是否接触过HIV病毒,但它不能确定是否存在HIV感染。因为HIV感染者的外周血淋巴细胞中仅万分之一含有病毒RNA,所以采用体外培养来使HIV病毒繁殖,往往需要三到四周,而且不稳定。如果采用PCR技术来扩增HIV病毒的保守序列,再鉴定HIV病毒,则不仅使诊断的敏感度大大提高,而且时间也大大缩短。

目前,国内用PCR检测病毒方面做得最多的是对肝炎病毒的检测,包括乙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒。采用PCR检测法可以测出每毫升血中仅0.4fg的乙肝病毒DNA,相当于130个病毒颗粒,其敏感度高于传统的检测法1000倍。可以清楚地看到,PCR以其特异、快速、敏感的特点必将成为临床微生物实验室的常规检测手段。

2)PCR在遗传病的诊断和研究中的应用

遗传病是一大类严重危害人类健康、影响人口质量的疾病。有些遗传病在胎儿出生后有一定的治疗手段,这一类遗传病如早期发现,便可早期治疗,防止其并发症特别是不可逆性的后果发生。而另一类遗传病目前尚无有效疗法,就应在患儿出生前做产前诊断,确诊后进行人工流产或引产,以保证人口质量,减少家庭和和社会负担。目前对遗传病的基因诊断方法主要是用DNA分子杂交和RFLP的方法,比较复杂、费时而且费用昂贵,PCR则为遗传病诊断提供了快速、简便而准确的手段。目前国内外采用PCR诊断的遗传病已有数十种,最常见的有α-地中海贫血、β-地中海贫血、镰刀状红细胞贫血、血友病、苯丙酮尿症、肌营养不良症亨延顿氏舞蹈症等。这些都是由于基因的突变缺失或重拍造成的遗传病。

镰刀状红细胞贫血是由于正常人的β-珠蛋白链第6位上正常的谷氨酸突变成缬氨酸所致,用一对引物扩增含有突变部位的DNA片段,产物用限制性内切酶UxaNI消化后,琼脂糖凝胶电泳,用溴化乙锭染色观察。正常人有三个扩增片段191bp、103bp和294bp。

DMD是男性中常见的一种性连锁致死性遗传病。DMD基因的双链DNA为14kb,序列已经清楚,大约50%~60%的病人存在基因的部分缺失。用双链DNA探针做Southern印迹可以检测基因的缺失,但必须用十余个探针,步骤多、时间长并且需要大量的完整的基因组DNA。Caskey等设计了多重PCR扩增系统,即加入多对位于一缺失的外显子中的引物,同时扩增。扩增后的产物可直接电泳观察,如有某个外显子缺失,就看不到相应的条带。这种方法快速、灵敏,可查出缺失型中的70%~80%。

3)在肿瘤的诊断、研究及残留癌细胞中的应用

肿瘤的发生与演进是一个多阶段的过程,其中包括多种癌基因的激活和抑癌基因的失活,一起上述改变的遗传学基础主要是点突变、重排、扩增和缺失等。PCR技术为检测这些DNA异常提供了敏感、快速和特异方法,这不仅促进了肿瘤分子遗传学的发展,并为临床肿瘤学上的应用开创了新的条件。

癌基因激活的检测

1、点突变的检测应用PCR技术检测点突变,须与其他技术相结合,主要方法有以下几种。

a、设计引物位于常见的点突变部位,在严格条件下进行扩增,由于突变碱基影响了引物的结合与延伸,结果无产物形成。

b、引物位于点突变两侧,当点突变引起限制性内切酶识别为点的改变时,则可用相应的内切酶处理扩增产物,可作出明确判断进行杂交。在严格杂交条件下,根据与何种ASO探针杂交,可判断有无突变及突变的类型。

d、扩增的片段直接进行DNA顺序分析,可直接测出突变点。

e、PCR产物单链构像多态性分析,这一方法是根据同一顺序位置的不同碱基替换,以及同一碱基在不同位置的替换,在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳上有不同的迁移率,来对基因突变作出分析。

2、嵌合基因的检测某些人类恶性疾病,如滤泡性淋巴瘤等,具有特异性染色体易位,因此形成了由不同基因组成的嵌合基因。因为在正常组织细胞中不存在这类嵌合顺序,所以用于易位点两侧DNA顺序互补的引物,扩增基因组DNA时则无靶DNA片段形成;如检测标本中存在携带易位的恶性细胞则有特异性DNA片段的扩增产物。

3、癌基因扩增的检测目前在20多种人类的肿瘤中,观察到约10多种癌基因的扩增去,其中乳腺癌的c-erbB-2癌基因和神经母细胞瘤的N-myc癌基因的扩增提示临床预后不良;另一方面,近年来的研究还发现,许多肿瘤对抗癌药物的抗药性,与p糖蛋白基因的扩增有关。因此新近发展起来的定量PCR技术对癌基因的扩增检测,具有明显的实践意义。

抑癌基因失活的研究

抑癌基因是其正常产物可防止细胞癌变的一组基因,它们的功能可能与细胞分化和控制细胞增殖有关。当抑癌基因的一对等位基因均丧失功能时,最终可能导致肿瘤的发生。引起抑癌基因失活的DNA损伤主要是点突变和缺失等,因此可用点突变的检测技术进行检测。较大的基因缺失的检测可在显微镜下进行染色体分析,微小缺失则可采用印迹杂交技术来鉴定,目前采用PCR技术非常简捷,且不需要同位素标记探针,其关键在于引物设计,主要有两种方式:1若缺失DNA片段不大,一对引物分别与缺失片段两侧顺序互补,在有抗癌基因缺失的肿瘤中,PCR扩增的靶DNA片段减小;2若缺失DNA片段较大,一对引物设计在缺失片段中,这样在有抑癌基因缺失的肿瘤,则无靶DNA扩增的产物。

3)残留癌细胞监测中的作用

医生想要确证正在治疗的白血病患者体内是否还有恶性细胞存在;对化疗和放疗的癌症病人,确定何时可以停止治疗;在体内重新发现了癌细胞后,又能重新开始治疗。在这些情况下,癌细胞的量非常少,PCR技术以其敏感性和特异性可为上述要求提供可靠的根据。

4)在性别鉴定中的作用

利用PCR技术鉴定性别在法医学鉴定、运动员性别鉴定、产前诊断中有重要意义。以产前诊断为例,因为遗传的X-连锁疾病紧影响男性,所以性别鉴定是产前诊断的第一步。男性在Y染色体有独一无二的序列,如3.5kb的DYZ1序列在Y染色体上有5000多个拷贝,用PCR技术扩增出DYZ1序列上的男性特异的一个149bp的片段,就可鉴定为男性。在一个产前性别鉴定实验中,研究人员用微量法从体外受精后的6个着床强的人胚胎细胞中个取出一个细胞,每个细胞的DYZ1序列利用PCR循环60圈,有扩增片段的胚胎就是男性胚胎

5)在法医鉴定中的应用

利用PCR技术可从犯罪现场的到的任何少量标本中扩增至少六个卫星DNA等位片段。标本可包括头发、唾液、精液、血斑和尿等。PCR大大增加了DNA指纹图谱法的实用性,为法医学上个体鉴定、亲子认定等提供了可靠的证物。首先用限制性内切酶将DNA切成许多长短不一的DNA片段,然后在凝胶上通过电压驱动使这些DNA片段以不同的速度通过凝胶。这样,DNA片段在凝胶中就按大小分来了。然后将DNA片段从凝胶上转印到尼龙膜上,加入放射性同位素标记的探针。探针与尼龙膜上的DNA结合,将X光胶片放在尼龙膜上,就可以显示出带有放射性同位素的的DNA片段来。X光片上的条纹就是长短不等的DNA片段图谱,看上去就像商品的条形码,称为“DNA指纹”。PCR技术对于RFLP方法制作DNA指纹图起到了至关重要的作用。犯罪现场留下的往往是蛛丝马迹,有时很难得到足量的纯的DNA样品用于RFLP分析。而号称“基因放大器”的PCR技术则使技术人员可以从哪怕一滴血、一根毛发等极少量的样品中扩增出足量的DNA分子来然后利用RFLP技术来作出DNA指纹。除通过RFLP技术制作DNA指纹图外,现在法医还可通过PCR直接分析法进行DNA分析进而侦破案件。

6)在器官移植配型中的应用

以骨髓移植为例,HLA_D抗原在骨髓移植排斥反应中占重要地位,常规混合淋巴细胞培养检测。近年来发展了一种更为精确的配型方法:HLA_DNA限制性片段长度多态性配型。其主要用途是作为常规配型的补充,尤其是MLC反应不能给出明确结论时,进行DNA配型的分析就显得尤为重要。其次是有些白血病患者难以进行血清学分析,有必要进行DNA配型作出最后的判断。但DNA-RFLP配型周期长,而且不能分析移植抗原的微多态性。用人工合成的寡核苷酸探针检测PCR产物能克服上述两个缺点。目前已成功地扩增了HLA_Daa、HLA_Dαβ、HLA-DRβ等基因,并且应用于移植配型。

二、基因克隆

在PCR技术发明之前,有关核酸研究所涉及的许多制备及分析过程,都是即费力又费时的工作。例如,为了将一种突变基因通其已经做了详细研究鉴定的野生型基因进行比较,首先就必须构建突变体的基因组文库,然后利用有关探针进行杂交筛选等一系列繁琐的步骤,才有可能分离得到所需的克隆。只有在这种情况下,才能对突变基因作核苷酸序列的机构测定并与野生型进行比较分析。然而用PCR技术便能在体外快速的分离到突变基因。其主要步骤是根据预先测定的野生型基因的核苷酸序列资料,设计并合成出一对适用的寡核苷酸引物,用来从基因组DNA中直接扩增出大量的突变基因DNA产物,以供核苷酸序列测定使用。

另外也可以根据需要在引物的5’端加上一段特殊的额外序列。按设计要求,在第一次杂交时,引物中的这一段额外序列因无互补性是不能参与杂交作用的,而只是其3’端的部分序列退火到了模板DNA的相应部位,在随后的反应过程中,此5’端的额外序列才掺入到了扩增的DNA片段上。由于这种加在5’端的额外序列可以根据实验者的特定需要而精心设计,因此在实际的研究工作中具有很大的应用价值,提供了很多的灵活性。

三、反向PCR与染色体步移

常规PCR的一个局限性是,它需要设计一对界定在靶DNA区段两端的扩增引物,因此它只能扩增量引物之间的DNA区段。然而有时我们也希望扩增位于靶DNA区段之外的两侧未知的DNA序列。这就需要应用反向PCR技术,它能够有效地满足此种需要,而且对于染色体步移也有实际用途。

反向PCR的基本操作程序:a、用一种在靶序列上没有切点的核酸内切限制酶消化相对分子质量较大的DNA;b、产生的不同大小的线性DNA片段群体,其中具靶DNA区段的DNA分分子长度不超过2~3kb,经连接后重新环化成环状分子;c、按靶序列设计的一对向外引物与靶序列5’端的互补序列退火结合;d、经PCR扩增产生的主要是线性双链DNA分子,它是由左侧序列和右侧序列首尾连接而成,其连接点是a中所有用的限制酶的识别位点。

重复进行反向PCR便可用来作染色体步移。但是能被反向PCR扩增的DNA长度是有限的,因此它只能沿染色体分子作较短的步移。

四、基因的体外诱变与突变的检测

基因的体外诱变是PCR技术的又一个重要的研究应用领域。它主要是利用寡核苷酸引物在碱基不完全互不配对的情况下亦能同模板DNA退火结合的能力,在设计引物时人为地造成碱基取代、缺失或插入,从而通过PCR反应将所需的突变引入靶DNA区段。然后将突变基因与野生型基因做功能比较分析,就可以确定所引入的突变的功能效应。这种PCR体外诱变技术也称重组PCR技术,在检测蛋白质与核酸的相互作用方面具有特殊的价值。

PCR技术不仅可以有效地体外诱发基因突变而且也是检测突变的灵敏手段。已经知道人类的癌症及其他一些遗传疾病是与基因突变有关的。显然,弄清楚突变的性质无论是对于诊断还是治疗都是具有十分重要的意义的。例如,许多癌症都与癌基因ras的突变有关,目前已应用PCR技术分析了该基因的突变模型及频率。应用PCR扩增可迅速的筛选大量的患者样品,具体应用如前文所述。

五、基因组的比较研究

在PCR反应中如果所用的寡核苷酸引物引物太短,那么所得的扩增产物将是一群长短不一的DNA片段混合物。这种情况虽对PCR扩增的特异性来说是不利的,但在此基础上发展的应用短片段的寡核苷酸引物所作的随机扩增,对于系统发育的研究却是十分有用的技术。重要的一点是用随机引物扩增出来的PCR产物,经琼脂糖凝胶电泳之后所呈现的带型反映着用作扩增模板DNA分子的总体结构特征。如果起始材料用的是细胞的总DNA,那么扩增的带型便代表着细胞基因组的总体特征。因此,应用随机引物的PCR扩增能够测出两个生物体基因组之间的差异。两个物种的个体之间,亲缘关系越接近,其相应的PCR扩增带型也就越相似反之则差异也就越悬殊。

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编辑:医学科学 本文来源:pcr是什么意思,实时定量PCR应用中的问题及优化

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